1. Възстановяване
●1. Извадете криопробирката от течния азот, незабавно я поставете във водна баня с температура 37 градуса и я разклатете леко. След като течността се разтопи (около 1-1,5 минути), извадете я, напръскайте малко алкохол и я поставете върху ултрачистата работна маса.
●2. Аспирирайте горната клетъчна суспензия в центрофужна епруветка от 15 ml, пълна с 10 ml среда (измийте епруветката за криоконсервация със среда, за да отмиете всички клетки, полепнали по стената), и центрофугирайте при 1000 rpm за 5 минути.
●3. Излейте супернатантата и добавете 1 ml среда за суспендиране на клетките. Аспирира се в 10 cm петриево блюдо, съдържащо 10 ml културална среда и внимателно се разклаща напред-назад, за да направят клетките в петриево блюдо равномерно разпределени.
●4. Етикетирайте типа клетка и датата, името на култиватора и т.н. и я поставете в CO2 инкубатор за култивиране. След като клетките прилепнат към стената, сменете средата.
●5. Сменяйте средата на всеки 3 дни.
2. Преминаване
●1. Пасаж, когато клетъчното покритие в съда с култура достигне 80 процента -90 процента.
●2. Аспирирайте оригиналната среда.
●3. Добавете подходящ трипсин (достатъчно да покрие клетките) и смилайте за 1-2 минути.
●4. След като клетките са закръглени, добавете равен обем среда, съдържаща серум, за да прекратите смилането.
●5. Използвайте пипета, за да суспендирате клетките чрез пипетиране.
●6. Аспирирайте клетките в центрофужна епруветка от 15 ml и центрофугирайте при 1000 rpm за 5 минути.
●7. Излейте супернатантата, добавете 1-2ml среда и надуйте клетките.
●8. Прехвърлете клетките в няколко съда в зависимост от вида на клетките. Обикновено има 5 ракови клетки и 3 нормални клетки. Продължете да се самоусъвършенствате.
3. Криоконсервация. Смилайте клетките и центрофугирайте (пак там). Суспендирайте клетките с приготвения разтвор за замразяване и ги разпределете в стерилизирани криостъкло, оставете ги да престоят няколко минути и посочете типа клетка и датата на криоконсервация. 4 градуса за 30 минути, -20 градуса за 30 минути, -80 градуса за една нощ и след това поставени в течен азот за съхранение. Приготвяне на разтвор за криоконсервация: 70 процента пълна среда плюс 20 процента FBS плюс 10 процента DMSO. DMSO трябва да се добавя бавно на капки, като се разклаща, докато капе.
