1. Възстановяване на клетките
След като криоконсервираните клетки бяха извадени от течния азот, те бяха размразени с постоянно разклащане във водна баня при 37 градуса. Прехвърлете размразените клетки в центрофужна епруветка, добавете предварително загрята DMEM пълна среда при 37 градуса (от която фетален говежди серум е около 10 процента), внимателно продухайте равномерно, центрофугирайте при 500 g за 2 минути и изхвърлете супернатантата.
Добавете пълна среда DMEM за промиване и изхвърлете супернатантата. Добавете пълна среда DMEM, разбъркайте внимателно чрез пипетиране, направете клетъчна суспензия, инокулирайте я в петриево блюдо/колба и култивирайте в клетъчен инкубатор, съдържащ 5 процента CO2.
2. Клетъчен пасаж
Когато клетъчната плътност достигне 80 процента ~90 процента (преждевременният добив е недостатъчен, твърде късните клетки са в лошо състояние, субкултивиране в съотношение от 1:2 до 1:10 или повече, обикновено 1:3 до 1:5 генериране на клетки, т.е. от клетъчна инокулация По време на отделяне и повторно култивиране, цялата среда беше отстранена и промита два пъти с 1Х PBS.
Добавете трипсин (забележка: количеството разтвор за смилане е най-добре да покрие клетките, а оптималната температура за смилане е 37 градуса. Наблюдавайте клетките под микроскоп: наблюдавайте смиланите клетки под обърнат микроскоп, ако цитоплазмата е прибрана, клетките вече не са свързани заедно. Срезове, което показва, че клетките се усвояват правилно в този момент), ги усвоете и ги поставете в клетъчен инкубатор за около 2-3 минути.
Добавете подходящо количество DMEM пълна среда, за да спрете трипсинизацията, прехвърлете в центрофужна епруветка и центрофугирайте при 500 g за 2 минути, изхвърлете супернатантата, добавете DMEM пълна среда за промиване и изхвърлете супернатантата.
Добавете пълна среда DMEM, разбъркайте чрез внимателно пипетиране, пипетирайте 10 микролитра за преброяване и след това продължете да култивирате в клетъчен инкубатор, съдържащ 5 процента CO2 според необходимия клетъчен обем.
3. Криоконсервация на клетки
Когато клетъчната плътност достигне 80 процента ~90 процента, отстранете цялата среда и измийте 2 пъти с 1X PBS. Добавете трипсин за смилане и поставете в клетъчен инкубатор за около 2-3 минути. Добавете пълна среда DMEM, за да спрете смилането на трипсин, прехвърлете в центрофужна епруветка и центрофугирайте при 500 g за 2 минути, изхвърлете супернатантата, добавете пълна среда DMEM за промиване и изхвърлете супернатантата. Добавете 1 ml разтвор за замразяване (90 процента фетален говежди серум, 10 процента DMSO. Най-общо казано, съдържанието на серума може да се регулира между 10 процента и 90 процента. Добавянето на серум към разтвора за замразяване може да осигури хранителни вещества за клетките, от една страна, и може Осигурете непропускливи защитни вещества по време на клетъчна криоконсервация, като захароза, албумин и др. за по-добра защита на клетките), поставете я в епруветка за криоконсервация (в епруветката има изопропилов алкохол, за да се гарантира скоростта на намаляване на температурата), поставете я незабавно Замразете в хладилник на 4 градуса за 30 минути, след това го поставете в хладилник на -20 градуса за 30 минути и след това го поставете в хладилник на -80 градуса за една нощ.
На следващия ден го сложете в течен азот, може да се съхранява поне две години, а ако не го сложите в течен азот, може да се съхранява три месеца.
Принципът на криоконсервация и възстановяване на клетки е: бавно замразяване и размразяване, което е по-благоприятно за поддържане на жизнеспособността на клетките. Криоконсервирането на клетки без никакъв защитен агент ще доведе до производството на вътреклетъчни ледени кристали, което ще причини ендогенно механично увреждане на клетките, ще причини промени в осмотичното налягане на вътреклетъчната среда, рН, електролити и т.н., и след това ще насърчи клетъчната смърт.
4. Въпроси, изискващи внимание
(1) Предварително загряване на културалния разтвор: поставете подготвената бутилка, съдържаща културалния разтвор, PBS и трипсин във водна баня от 37 градуса за предварително загряване;
(2) Използвайте 75 процента алкохол, за да избършете ултрачистата работна маса и ръцете, които са били облъчени с ултравиолетови лъчи;
(3) Правилно разположение на използваните инструменти: осигурете достатъчно работно пространство, което е не само лесно за работа, но и намалява замърсяването;
(4) Запалете алкохолната лампа: имайте предвид, че пламъкът не трябва да е твърде малък;
(5) Строга асептична работа;
(6) Умерено смилане на прилепнали клетки: Времето за смилане се влияе от много фактори като вида на разтвора за смилане, времето за приготвяне и количеството, добавено в колбата с култура. По време на процеса на смилане трябва да се обърне внимание на промените във формата на култивираните клетки. След като цитоплазмата се свие, ако връзката се разхлаби или има признаци на плаващи парчета, смилането трябва да бъде прекратено незабавно;
(7) Всички операции върху пасирани клетки трябва да се извършват възможно най-близо до пламъка на спиртна лампа. Най-добре е да работите само с една клетка в даден момент, като използвате един комплект оборудване за всяка клетка. избягвайте кръстосана инфекция;
(8) Гърлото на бутилката на пасираната клетка трябва да се стерилизира върху спиртна лампа при всяко отваряне или затваряне.
