В следепидемичния период терминът „изследване на нуклеинови киселини“ е познат на всички ни и се превърна в част от ежедневието ни.
И така, знаете ли как тестването на нуклеинова киселина открива вируси? И как тестването на нуклеинова киселина прави невидимите вируси "видими"?
01 Какво е нуклеинова киселина
Нуклеиновата киселина е общият термин за ДНК и РНК.
Нуклеиновата киселина е основен компонент на целия познат живот на земята. ДНК, която често казваме, е дезоксирибонуклеинова киселина. Генетичният материал на новия коронавирус е РНК - рибонуклеинова киселина.
Тестване за амплификация на нуклеинова киселина
02 Какво точно открива тестът за нуклеинова киселина?
Веществото за откриване на нуклеинова киселина е нуклеиновата киселина на вируса.
Новият коронавирус е вирус, който съдържа само РНК, а специфичната РНК последователност във вируса е маркер, който разграничава вируса от други патогени. Откриването на нуклеинова киселина е, за да се установи дали има нуклеинова киселина на чужд нахлуващ вирус в респираторната проба или кръвта на пациента, за да се определи дали той е заразен с новия коронавирус. По-голямата част от настоящото откриване на нуклеинови киселини на новия коронавирус използва флуоресцентния количествен PCR метод за усилване на целевата последователност на вирусната РНК чрез PCR след обратна транскрипция.
PCR или полимеразна верижна реакция е техника на молекулярна биология, използвана за амплифициране на специфични ДНК фрагменти; отнася се до катализираната от ДНК полимераза реакция на специфични гени или Реакцията на бърза in vitro амплификация на ДНК последователности се нарича още генна in vitro амплификация. Флуоресцентната количествена PCR технология е да добави флуоресцентна репортерна система към PCR реакционната система и да използва промяната на флуоресцентния сигнал за наблюдение на PCR процеса в реално време, така че да се реализира количественото откриване на първоначалния шаблон.
За да се открие нуклеинова киселина, първата стъпка е да се вземе проба. Понастоящем най-конвенционалният метод за вземане на проби е: използвайте тампони от гърлото или носа за избърсване и събиране на горните дихателни пътища (фаринкса или носната кухина); събраните проби ще бъдат строго запечатани и след това изпратени в лабораторията за поетапно изследване.
1. Екстракция на вирусна РНК
РНК на вируса първо се извлича от пробата. Добавете реагенти за екстракция на нуклеинова киселина към пробата, за да унищожите вируса и да освободите нуклеиновата киселина.
2. "Обратна транскрипция" на вирусна РНК в сДНК
Чрез технологията за обратна транскрипция (RT) РНК на вируса се „превръща“ в специфична ДНК, която е по-удобна за откриване, тоест cDNA.
3. Амплификация и откриване на cDNA
Всъщност, независимо дали става дума за тампон от гърло, нос или дори кръвна проба, съдържанието на вирус в пробата е сравнително ниско, дори при тежко инфектирани пациенти (вирусният товар е голям); тъй като вирусните частици са твърде малки и обемът на пробите е ограничен, броят на вирусите, съдържащи се в пробата, все още е твърде малък за откриване на нуклеинова киселина.
Затова с помощта на PCR технологията инспекторите усилват уникалната „парола“ на новия коронавирус в пробата до точката, в която апаратурата може да я засече, за да прецени дали е положителна инфекция. Целият процес на грабване на генетичния материал на вируса е като риболов. Куката ще го идентифицира и ще го грабне, така че вирусът да няма къде да се скрие.
Просто казано, това е да се увеличи броят на cDNA, така че cDNA да се репликира непрекъснато, така че броят да нараства експоненциално.
Стандартният PCR процес е разделен на три стъпки:
Денатурация: Използването на висока температура за разделяне на двойните вериги на ДНК. Водородните връзки между двойните вериги на ДНК се разкъсват при висока температура (93 - 98 градуса).
Отгряване: След като двойните вериги на ДНК се разделят, температурата се понижава, за да позволи на праймерите да се свържат с едноверижната ДНК.
Удължаване: ДНК полимеразата синтезира комплементарна верига по дължината на ДНК веригата от праймера, свързан, когато температурата се понижи. Когато удължаването приключи, един цикъл е завършен и броят на ДНК фрагментите се удвоява. Повторете тези три стъпки 25-35 пъти и броят на ДНК фрагментите ще се увеличи експоненциално.
PCR двуверижен шаблон
Докато cDNA се амплифицира, флуоресцентните сонди в комплекта работят едновременно. Той ще освободи флуоресцентен сигнал и всеки път, когато cDNA се усилва, флуоресцентният сигнал ще се увеличи малко и PCR детекторът може да запише Ct стойност на увеличение на флуоресцентния сигнал.
Стойността на Ct е важен индикатор за преценка дали вирусната нуклеинова киселина е отрицателна или положителна. Колкото по-малко е първоначалната ДНК, толкова повече PCR цикли са необходими за достигане на определен праг и толкова по-висока е стойността на Ct. Обратно, колкото повече е първоначалната ДНК, толкова по-ниска е стойността на Ct. Първоначалното количество ДНК отразява количеството вирусна РНК в пробата, което от своя страна отразява количеството вирус в пробата. Следователно, ако стойността на Ct не се открие или е по-висока от определена стойност, тогава предполагаемият пациент се оценява като отрицателен; ако е по-ниска от тази стойност, тогава предполагаемият пациент се оценява като положителен.
По време на PCR реакцията изборът на PCR консумативи също е един от най-важните фактори, влияещи върху резултатите от откриването на нуклеинова киселина.
