Когато току-що сте завършили и сте постъпили на работа, вие се сблъсквате с куп съществителни, изправени пред количествени PCR експерименти в реално време. Объркани ли сте откъде да започнете? Какво е значението на крива на усилване, стандартна крива, праг, CT стойност, крива на топене и базова линия? Флуоресцентните изображения от тези експерименти са твърде ярки, но изглежда не мога да ги идентифицирам. Днес ще ви отведем да научите тези знания и концепции в две части: технически термини и често задавани въпроси.
Част I Професионални условия
1. Крива на усилване
Кривата на амплификация се отнася до кривата, където номерът на цикъла е абсцисата, а интензитетът на флуоресценция в реално време по време на реакцията е ординатата по време на PCR.
2. Базово ниво
Базовата линия се отнася до малка промяна във флуоресцентния сигнал по време на първите няколко цикъла на реакция на PCR амплификация. Нивото на сигнала показва близо до права линия, която е базовата линия.
3. Настройка на прага на флуоресценция
Обикновено флуоресцентният сигнал от първите 15 цикъла на PCR реакцията се използва като флуоресцентен фонов сигнал, а прагът на флуоресценция е 10 пъти стандартното отклонение на флуоресцентния сигнал по време на 3-15 цикъла на PCR и прагът на флуоресценция се задава по време на експоненциалната фаза на PCR амплификация. Обикновено всеки инструмент има свой праг на флуоресценция преди употреба.
4. CT стойност
CT стойността представлява броя на циклите, които ще се появят за всяка PCR реакционна епруветка, когато флуоресцентният сигнал достигне зададения праг. От изследванията знаем, че има линейна връзка между CT стойността на всеки шаблон и логаритъма от началния номер на копие на този шаблон. Колкото по-голям е първоначалният брой копия, толкова по-малка е стойността на CT и обратно. Като се използват стандарти с известни начални номера на копия, може да се направи калибровъчна крива, където абсцисата представлява логаритъм на началния номер на копие, докато ординатата представлява CT стойността. Следователно, докато се получи CT стойността на неизвестната проба, първоначалният брой копия на пробата може да се изчисли от стандартната крива.
знам повече
Има няколко индикатора, за да се прецени дали кривата на усилване е добра или не:
Отговор: Точката на инфлексия на кривата е очевидна, особено експоненциалната фаза на пробата с ниско-тежка фракция е очевидна, общият паралелизъм на кривата на усилване е много добър, базовата линия е плоска, няма феномен на нарастване и усилването кривата на пробата с ниско ниво на експоненциална фазова концентрация е много добра. очевидно.
B: Наклонът на експоненциалната фаза на кривата е право пропорционален на ефективността на усилване, колкото по-голям е наклонът, толкова по-висока е ефективността на усилването.
C: Стандартната базова линия е равна или леко намаляваща, без видима възходяща тенденция.
D: Успоредността на кривите на усилване за всяка епруветка е добра, което показва, че ефективността на усилване на всяка реакционна епруветка е сходна.
5. Крива на топене
Когато PCR продуктът се нагрее, с повишаване на температурата, двойноверижният продукт на амплификация постепенно се дисоциира, което води до намаляване на интензитета на флуоресценция. Когато се достигне определена температура, голямо количество продукт се отделя, което води до рязко намаляване на флуоресценцията. Използването на тази функция заедно с различни TM стойности за различни PCR продукти също се различава в температурата, при която флуоресцентният сигнал бързо намалява, което може да е добър начин за идентифициране на PCR специфичността.
6. Крива на топене (с помощта на логаритмична крива)
Пиковата графика се формира от логаритъма на кривата на топене, за да покаже по-интуитивно положението на фрагментите от продукта. Тъй като температурата на топене е TM стойността на ДНК фрагмент, могат да бъдат определени определени параметри, влияещи върху TM стойността на ДНК фрагмент, като размер на фрагмента, съдържание на GC и т.н. Като цяло, според нашия принцип на проектиране на праймера, обикновено се казва че дължината на амплифицирания продукт е в диапазона 80-300bp, а температурата на топене трябва да бъде между 80 градуса и 90 градуса.
О: Ако има само един основен пик между 80 градуса и 90 градуса, това означава, че PCR в реално време е перфектен.
B: Ако основният пик се появява между 80 градуса и 90 градуса, а пикът на примесите се появява под 80 градуса, основно се взема предвид праймерът-димер. Това е добър вариант да се опитате да разрешите чрез повишаване на температурата на отгряване.
C: Ако основният пик се появява между 80 градуса и 90 градуса, а блуждаещ пик се появява, когато температурата се повиши, основно се разглежда ДНК замърсяване. И ДНК трябва да бъде премахната в началните етапи на експеримента.
7. Стандартна крива линия
Стандартните стандарти се разреждат до различни концентрации и се използват като шаблони за PCR реакции. Стандартната крива се начертава с логаритъм от номера на стандартното копие като абциса и измерената CT стойност като ордината. Когато се определя количествено неизвестна проба, броят на копията на пробата може да се получи от стандартната крива въз основа на CT стойността на неизвестната проба. Стандартните криви са много важни за абсолютното количествено определяне.
втората част. често срещан проблем
В1: Каква е разликата между RT-PCR, QPCR, PCR в реално време и RT-PCR в реално време?
A1: RT-PCR е PCR с обратна транскрипция, който е широко използван вариант на полимеразна верижна реакция. При RT-PCR веригата на РНК се транскрибира обратно в комплементарна ДНК, която след това се използва като шаблон за PCR за амплифициране на ДНК чрез PCR.
PCR в реално време и QPCR са едно и също нещо, и двете са количествени PCR в реално време, което означава, че има запис на данни в реално време при всеки цикъл по време на PCR процеса. По този начин броят на шаблоните за стартиране може да бъде прецизно анализиран.
Въпреки че PCR в реално време и PCR с обратна транскрипция изглежда се съкращават като RT-PCR, международната конвенция е, че RT-PCR се отнася конкретно до PCR с обратна транскрипция, докато PCR в реално време често се съкращава като qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - времева PCR).
RT-PCR в реално време (RT-QPCR) е вид PCR с обратна транскрипция, който комбинира флуоресцентни количествени техники: първо обратна транскрипция от РНК за получаване на cDNA (RT), последвано от количествен анализ с помощта на PCR в реално време (QPCR).
В2: Защо дължината на амплифицирания фрагмент от продукта на флуоресцентна количествена PCR се контролира в диапазона от 80-300bp?
A2: Дължината на всяка генна последователност е различна, някои от тях са няколко Kb и стотици BP. Въпреки това, когато проектираме праймера, трябва само да изискваме дължината на продукта да бъде 80-300bp, а твърде късият или твърде дългият не е подходящ за количествено откриване на PCR.
Продуктовите фрагменти са твърде къси, за да бъдат разграничени от праймери-димери. Дължината на праймер-димера е около 30-40bp, когато е по-малка от 80 bp, е трудно да се разграничи дали е праймер-димер или продукт. Ако фрагментът на продукта е твърде дълъг, надвишаващ 300 bp, това лесно ще доведе до ниска ефективност на амплификация и количеството ген не може да бъде ефективно открито.
Например, когато преброите броя на хората в една класна стая, трябва да преброите само колко усти има. Същото важи и при тестването на гени. Трябва само да откриете определена последователност от ген, за да представите цялата последователност. Лесно е да направите грешка, ако броите и устата, и носовете, ушите и очилата, за да преброите хората.
В3: Каква е оптималната дължина за дизайна на грунда?
A3: Най-общо казано, дължините на праймера в диапазона от 20-24bp са добри. Разбира се, трябва да обърнем внимание на TM стойността на грунда при проектирането на грунда, тъй като тя е свързана с оптималната температура на отгряване. След много експерименти е доказано, че 60 градуса е добра TM стойност. Ниската температура на отгряване може лесно да доведе до неспецифично усилване, докато високата температура на отгряване обикновено води до ниска ефективност на усилване, късен пик на кривата на усилване и забавена CT стойност.
Въпрос 4: Количеството събрана проба влияе ли върху експерименталните резултати?
A4: Не. Очевидно колкото повече проби са събрани, толкова повече РНК е извлечена, толкова повече сДНК и повече целеви фрагменти ще има. За абсолютно количествено определяне е необходимо да се изчисли броят на копията на целевия фрагмент и количеството събрана проба определено ще повлияе на експерименталните резултати. Например, откриването на вируса на хепатит С HBV в кръвта е да се открие съдържанието на HBV в определено количество (1 ml) кръв.
За относителното количествено определяне, което обикновено се използва в научните изследвания, броят на пробите няма нищо общо с експерименталните резултати, тъй като относителното количествено определяне се отнася до сравнението между целевия ген и референтния ген. Просто, моля, разглеждайте ги като фрагменти нагоре и надолу по веригата, присъстващи в една и съща верига на нуклеинова киселина. Ако размерът на пробата е голям, референтните и целевите гени се увеличават в равни пропорции едновременно, което не влияе на резултатите.
Въпрос 5: Ще повлияе ли ефективността на обратната транскриптаза върху експерименталните резултати?
A5: Същото като по-горе. Имайте предвид, че искаме по-висока ефективност на RT, но предпочитаме RT ензимът да е относително стабилен и да получава еднакви резултати. Това ще бъде тест за оптимизираните възможности на пакетите за обратна транскрипция на големите компании.
Въпрос 6: Влияе ли ефективността на ензима TAQ върху експерименталните резултати?
A6: Ефективността на TAQ ензима е относително голяма. Обикновено се изискват taq ензими с горещ старт и те са относително ефективни. За търговски флуоресцентни количествени комплекти всеки производител ще оптимизира ефективността на най-доброто състояние според собствените си продукти близо до 100 процента, ако ефективността е твърде ниска, експерименталните резултати не могат да бъдат получени. За продуктите на различни компании това е мярка за качество.
Въпрос 7: Количеството флуоресцентно багрило влияе ли върху експерименталните резултати?
A7: Да, ще стане. Ако флуорохромът е твърде наситен, това може да причини шумови смущения в някои инструменти. Ако флуорохромът не е наситен и стойността на флуоресценцията е твърде ниска, той ще влезе във фаза на плато рано и кривата на усилване ще бъде плоска. В количествения експеримент на флуоресценцията се вижда главно стойността на CT, така че не е важно кривата на късното усилване да навлезе в стадия на платото, но картината не е достатъчно красива. Ако трябва да избирате, започнете с избора на флуорохром, който е малко по-малко наситен. Въпреки това, когато използвате един и същ продукт от една и съща компания, неговият ефект е по принцип незначителен.
Въпрос 8: Ще повлияе ли предаването на PCR епруветката на експерименталните резултати?
A8: Да. Въпреки това, за една и съща партида консумативи от същия производител, този ефект може да бъде пренебрегнат. Това е добър избор и е най-добре да използвате 96-плака с ямки с мембрана с висока пропускливост, за да сведете до минимум ефекта от светлопропускливостта на консумативите.
Q9: Грешките по време на работа ще повлияят ли на експерименталните резултати?
A9: Влиянието на процеса на работа се отразява главно в еднообразието. Хомогенността означава, че всички компоненти в системата са равномерно смесени и флаш центрофугирането може да реши този проблем. В допълнение, за начинаещи е най-добре да настроите PCR системата да бъде повече от 20 инча, а твърде малка система е по-податлива на грешки. Ако температурата на отгряване е оптимизирана правилно, ефектът от концентрацията на праймера върху CT е сведен до минимум. И ще знаете, че някои оперативни грешки (като концентрацията на праймера) могат да бъдат избегнати чрез оптимизиране на температурата на отгряване.
Обобщете
По-горе са някои въпроси и въпроси, които новаците често срещат по време на експеримента, надяваме се, че тези въпроси могат да ви помогнат да разрешите известно объркване. Експериментирането е процесът на генериране на хаос и решаване на проблеми, надяваме се да получите нещо от него. Благодаря за четенето и ще се видим следващия път!
