Клетъчната култура е един от най-важните инструменти, използвани в клетъчната и молекулярната биология, осигуряващ отлична моделна система за изучаване на нормалната физиология и биохимия (напр. метаболитни изследвания, стареене), ефектите на лекарствата и токсичните съединения върху клетките, както и ефектите на клетъчна мутагенеза и канцерогенеза. Използва се и при скрининг и разработване на лекарства и в широкомащабно производство на биологични съединения (напр. ваксини, терапевтични протеини). Основно предимство на използването на клетъчна култура за всяко от тези приложения е последователността и възпроизводимостта на резултатите, които могат да бъдат получени чрез използване на партида от клонални клетки.
клетъчна култура
Клетъчната култура се отнася до отстраняването на клетки от животни или растения и тяхното отглеждане в благоприятна изкуствена среда. Клетките могат да бъдат отстранени директно от тъканта и дисоциирани ензимно или механично преди култивиране, или могат да бъдат получени от установени клетъчни линии или щамове
1. Начално обучение
Първичната култура се отнася до етапа на култура, след като клетките са били изолирани от тъкан и размножени при подходящи условия, докато заемат целия наличен субстрат (т.е. достигнат сливане). На този етап клетките трябва да бъдат субкултивирани (т.е. пасирани) чрез прехвърлянето им в нов контейнер със свежа хранителна среда, за да се осигури повече място за продължаване на растежа.
2. Клетъчни линии
След първата субкултура, първичните култури се наричат клетъчни линии или субклонове. Клетъчните линии, получени от първични култури, имат ограничен живот (т.е. те са ограничени) и когато се пасират, преобладават клетки с най-висок потенциал за растеж, което води до известна степен на генотипна и фенотипна еднаквост в пола на популацията.
3. Клетъчни линии
Клетъчна линия става клетъчен щам, ако субпопулация от клетъчната линия е активно селектирана от култура чрез клониране или други методи. Клетъчните линии често придобиват допълнителни генетични промени след началото на родителската линия.
4. Ограничени клетъчни линии и непрекъснати клетъчни линии
Нормалните клетки обикновено се делят само ограничен брой пъти, преди да загубят способността си да пролиферират, генетично определено събитие, наречено стареене; тези клетъчни линии се наричат крайни. Някои клетъчни линии обаче стават безсмъртни чрез процес, наречен трансформация, който може да възникне спонтанно или да бъде индуциран химически или вирусно. Една ограничена клетъчна линия се превръща в непрекъсната клетъчна линия, когато претърпи трансформация и придобие способността да се дели неограничено.
Непрекъснато култивираните клетъчни линии са склонни към генетичен дрейф, крайните клетъчни линии са обречени на стареене, всички клетъчни култури са податливи на микробно замърсяване и повреда на оборудването може да възникне дори в най-добре управляваните лаборатории. Тъй като установените клетъчни линии са ценен ресурс, чиято подмяна е скъпа и отнема много време, от съществено значение е те да бъдат криоконсервирани за дългосрочно съхранение.
След като се получи малък брой останали клетки от субкултурата, те трябва да бъдат замразени като семенен материал и защитени от обща лабораторна употреба. Работните запаси могат да се приготвят и попълват от замразени запаси от семена. Ако запасът от семена е изчерпан, тогава криоконсервираният работен запас може да се използва като източник за приготвяне на пресен запас от семена, което води до минимално увеличение на количеството от първоначалното замразяване.
Най-добрият начин за криоконсервиране на култивирани клетки е в течен азот, в пълна среда, в присъствието на криопротектори като диметилсулфоксид (DMSO) или глицерол. Криопротекторите понижават точката на замръзване на средата и също така намаляват скоростта на охлаждане, като значително намаляват риска от образуване на ледени кристали, което може да увреди клетките и да доведе до клетъчна смърт.
Известно е, че DMSO улеснява навлизането на органични молекули в тъканите. При работа с реагенти, съдържащи диметилсулфоксид, трябва да се използва оборудване и практики, подходящи за опасностите от този материал. Изхвърлете реагентите в съответствие с местните разпоредби.
Отглеждайте клетки от замразени работни клетъчни запаси
Не забравяйте да попълните дневника на мобилното банкиране
Определете броя на пасажите, например ако предишните клетки са били замразени и са били размразени три пъти, процесът на размразяване ще бъде четвъртият пасаж.
Добавете растежна среда (минимална среда, телешки серум и антибиотици) към T75 колби, маркирани с клетъчна линия, номер на пасаж и дата
Поставете колбата хоризонтално в CO инкубатор при 37 градуса и 5 процента CO за най-малко 15 минути. Това ще затопли средата и ще я доведе до нормалното й pH (7.0-7.6)
Размразете замразените флакони с клетъчни линии на 37-градусова водна баня с леко разбъркване. За да намалите риска от замърсяване, дръжте уплътнителния пръстен и капачката над нивото на водата (2-5 минути).
Поставете флакона в шкаф за биологична безопасност (BSL-2). За да избегнете замърсяване, избършете със 70 процента етанол, преди да отворите флакона.
Прехвърлете съдържанието на колбата със замразени клетки в колба T75, съдържаща среда за растеж. Смесете и разклатете внимателно колбата, за да разпределите равномерно клетките по повърхността на колбата.
Инкубирайте колбата за една нощ в CO2 инкубатор при 37 градуса с 5 процента CO2. Оставете клетките да се прикрепят за една нощ
променяща се среда на растеж
Инкубирайте колбата за още 2-4 дни при 37 градуса, 5 процента CO2 и наблюдавайте, докато клетките растат
След като клетките достигнат приблизително 90 процента конфлуентност, запасът от клетки може да бъде разширен с помощта на колба T150
